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          RNAstorm?試劑盒

          全球領先的雜志Nature chemistry報道的FFPE樣本RNA抽提技術來了!在某些樣本中得率比Kit Q有較大改善,RNA完整性高至4K。

            為了更好的進行NGS測序,使用RNAstorm?試劑盒催化FFPE石蠟標本的核酸抽提,具有更高得率和 更完整RNA,制備文庫用于RNA-Seq

           

           

          簡介

          活檢和手術標本通常用甲醛固定、石蠟包埋(FFPE)的 常用模式保存。雖然甲醛使組織更穩定有利于保存,但是樣 本內部的核酸和其他生物分子也形成廣泛的交聯和加合物。 目前的方法主要依賴于加熱來去除交聯和加合物,但只是部 分有效,并且導致核酸例如RNA的不穩定和斷裂。相比之 下,Cell Data Sciences公司開發的RNAstorm?試劑盒, 包含CAT5?催化技術,極大地加快了甲醛損傷的去除,并 且可以在常溫環境下進行,明顯提高了RNA的回收率。此技 術增強了產生大量高質量核酸的機會,從而可用于多樣化的 應用,包括RNA測序或其他NGS,qPCR, 生物芯片和基因表達分析

          The RNAstorm? 試劑盒

          RNAstorm?提取試劑盒包含加快甲醛誘導加合物改變 的化學催化劑,包括烷基化和交聯堿基。 試劑盒提供了從石蠟組織樣本提取RNA所必需的所有試 劑,右邊是用戶操作流程(見圖),大約1小時以內完成。 用切片機進行石蠟切片,首先用無毒無二甲苯的試劑去 除包埋組織的石蠟。其次,組織用CAT5?試劑處理,并且 用蛋白酶裂解。RNA結合到柱子上并沖洗,用DNase I去除 基因組DNA的污染。最后,用無RNA酶的水或低鹽緩沖液 洗脫獲得純的RNA

          評價FFPE來源的RNA的質量和數量
          以下技術通常用來評價一個RNA樣品的質量:
          簡單的濃度測量采用紫外光譜法(例如NanoDrop?) 或利用RNA特異性熒光染料(如Qubit?)。
          RNA的完整性使用凝膠或毛細管凝膠電泳方法,例如安 捷倫生物分析儀儀器,并表示為一個RIN數字或DV200百 分比。
          測量應用性,這直接取決于足夠的化學去修飾或未交聯 由反轉錄酶和酶處理的RNA的數量。選擇的方法是定量RTPCR,結果可以表示為一個Ct數或相對或絕對量的RNA。 在NGS文庫制備中,應用性是對輸入核酸的最可靠的方 法。

          圖1。從六個不同的FFPE標本RT-PCR定量RNA恢復的比較?!癒it Q“代 表了一個市場領先的競爭商業基因組提取試劑盒。相對量 RNA從每個樣品 中觀察到的CT值。
          對正常的腫瘤石蠟標本的幾種類型。最老的石蠟樣品是在 1976年,最新的在2015年。 定量RT-PCR方法擴增RNA的相對定量。測量Ct值均一式三 份。一個83 bp的擴增產物從一個高表達基因(TPT1)中 使用,熔融曲線 確保放大的特異性分析

          定量RT-PCR是判斷一個RNA樣品整體質量最好的方 法,因為它依賴于濃度,完整性,以及樣品應用性,因此這 說明 主要依靠qPCR數據。其他的方法有著明顯的缺陷,尤 其是對FFPE樣品中RNA的降解。具體來說,Nanodrop?和 Qubit? 措施可以高度準確。毛細管電泳是核酸碎片程度的 有用指標,雖然RIN數與下游分析不能完全相關,不同質量 的樣品有非常相似的RIN數。DV200(RNA片段率>200 bp)是首選措施,尤其是當結束在Illumina平臺使用RNAseq時。這個度量因此作為估計RNA完整性的一點。
          檢測從FFPE樣品恢復的擴增RNA Cell Data Sciences’的商業RNAstorm? RNA FFPE 基因組提取試劑盒是在幾個FFPE樣品中測試。為確保RNA 回收的可重復性和定量測量,對石蠟包埋切片提取各一式三 份組織塊采用RNAstorm?試劑盒和一個流行的商業試劑盒 (試劑盒Q)。

           

          注: 從 FFPE 樣品中提取RNA
          RNA的相對量基于在圖1中Ct值的觀察和繪制,其中Ct差對 應濃度的兩倍的差異。 RNAstorm? 試劑盒大大提高了擴增RNA的產量 對所有樣本進行檢測,如圖1所示,重要的和一致的增加是 通過定量PCR檢測觀察的。Ct值通過RNAstorm? 試劑盒 相對于試劑盒Q的比較值如表1所示。
          表1.恢復擴增RNA的成倍增加,從圖2 Ct值推斷,通過定量RT-PCR檢

          樣本 Ct (RNAstorm) Ct (Kit Q)
          正常肝臟 1 29.2 32.5
          正常肝臟2 30.8 35.8
          正常腎臟 29.5 31.3
          腎上皮癌細胞 31.4 36.1
          結直腸癌1 30.4 32.1
          結直腸癌2 28.1 31.0

          表1.恢復擴增RNA的成倍增加,從圖2 Ct值推斷,通過定量RT-PCR檢 測,使用RNAstorm試劑盒優于Kit Q

          圖2。毛細管電泳分析測量的RNA的大小分布(安捷倫2100生物分析 儀)腎細胞癌樣本顯示RNA與RNAstor獲得改進的完整性 ,應用 RNAstorm? 試劑盒。

          圖3?;诎步輦惿锓治鰞x毛細管電泳結果dv200測量RNA完整性的 比較?!癒IT Q”代表一個市場領先的競爭商業基因組提取試劑盒

          而通過Qubit 測量的RNA濃度也普遍較高(數據未顯 示),這些濃度差異不足以解釋RNAstorm? 試劑盒相對 于試劑盒Q的Ct值的差。這表明RNA的完整性和化學修飾性 和交聯程度在測試樣品中扮演重要角色,并在FFPE樣品 qPCR表現一般。 增加RNA完整性是使用RNAstorm?試劑盒觀察的 利用毛細管電泳觀察RNA完整性增加。樣品用6000納米的 總RNA試劑盒,在Agilent 2100生物分析儀儀器處理,數 據 使用Agilent專業軟件分析。作為一個例子,獲得組織樣 本的痕跡(腎細胞癌)在圖2中顯示的。
          如上所述,在RIN的數字代替DV200,如圖3所示。30%的 值已經由Illumina公司確定允許RNA測序文庫制備與Tru Seq試劑進行閾值。這里,大多數樣品測試取得了DV200的 值小于30%,與競爭對手的試劑盒測試時。相反,在 RNAstorm試劑盒觀察值明顯升高47~70%。
          結論
          據估計,數億患者FFPE樣品是目前在世界范圍內存在的生物銀行,每年產生數以百萬的新樣本。由于可通過NGS下一 代測序的方法豐富信息,分析該病人數據的需求將繼續增加。然而,核酸提取方法迄今未能提供必要的核酸測序可靠質 量。NGS庫準備依靠多個酶促步驟,包括反轉錄和擴增,這需要高度的核酸完整性和應用性。RNAstorm?試劑盒提供的 樣品處理液專為先進的下游應用,允許最終用戶可靠地挑戰瑪琳固定標本這種有價值的工作。

                 參考文獻:

          1. Karmakar et al., Organocatalytic Reversal of Formaldehyde Adducts of RNA and DNA Bases, Nature Chemistry 2015, 7, 752758; doi:10.1038/nchem.2307 2. Arreaza et al., Pre-Analytical Considerations for Successful Next-Generation Sequencing (NGS): Challenges and Opportunities for Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tumor Tissue (FFPE) Samples, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1579; doi:10.3390/ ijms17091579 3. Evaluating RNA Quality from FFPE Samples: Guidelines for obtaining high-quality RNA sequencing results from degraded RNA with the TruSeq? RNA Access Library Preparation Kit, Illumina Inc., downloaded at http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote-truseq-rna-access.pdf

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            CD501 (50 reactions) CELLDATA
            CD201 (20 reaction sample kit) CELLDATA
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